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    熒光定量pcr常見問題的可能原因與解決方案

     更新時間:2022-11-23 點擊量:731
      熒光定量pcr常見問題的可能原因與解決方案
      無Ct值或Ct值延遲出現:擴增曲線信號不佳,曲線不平滑:標準曲線線性差。
      1.擴增產物大小不合適:實時熒光定量PCR擴增片段的長度通常在80-150 bp之間,如果調整反應的時間有可能擴增500bp的片段。
      2.PCR反應過程中退火及延伸的時間過短或過長:應根據擴增片段的大小予與調整。
      3.MgCl,濃度不合適:按0. 5mm的間距調整MgCI2的濃度。
      4.循環數設置不足:最少設置35個循環,可以增加到45個循環。超過45個循環以上背景信號會增加,對實驗結果的分析造成干擾。
      5.在錯誤的PCR反應步驟采集信號:應檢查程序設置確保信號的采集是在退火的步驟進行的。
      6.加樣的誤差及錯誤:注意每次加樣的一致性及移液器的校正。
      7.DNA模板的起始濃度過低,不能被檢測出來:如果模板的濃度未知,最初的實驗可以采用較高濃度的模板并進行梯度稀釋。最高的模板濃度不超過500ng基因組DNA。
      8.模板DNA的降解:使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA模板是否降解,檢查DNA模板的儲存條件是否合適,如果確認降解應重新制備新鮮的DNA模板。
      9.梯度稀釋標準樣品的方法不規范:應注意梯度稀釋樣品的操作規范,準確。
      10.引物或探針設計有誤,存在二級結構:通過瓊脂糖凝膠電泳檢測熒光定量PCR反應結果,是否有PCR產物存在。如果沒有PCR擴增產品,應使用引物設計軟件檢查引物的各種指標是否合適: Tm. 與模板的批配度、 二級結構、擴增片段的長度、非特異型擴增的情況。具體的數據請翻閱前面的相關原理說明
      11.引物之間的Tm值相差過多:上下游引物的Tm值差不應超過4C。
      12.引物或探針的使用濃度不合適:應將濃度控制在50- 900 nM之間,探針的濃度低于引物的濃度。
      13.引物或探針降解:使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA模板是否降解,檢查DNA模板的儲存條件是否合適,如果確認降解應重新制備新鮮的DNA模板。
      14.探針設計的位置在擴增片段的5’端:應將探針設計的位置靠近擴增片段的3”端
      15.探針被氧化:避免用酸性溶液溶解探針,否則會產生高背景熒光信號及低的擴增信號。推薦的緩沖液是pH8.0的TE緩沖液中。
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