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    PCR反應體系與反應條件

     更新時間:2023-07-21 點擊量:266

    PCR反應體系與反應條件

    PCR(聚合酶鏈反應)在遺傳學、生物醫學和生物工程等領域具有廣泛的應用。PCR反應體系是指所有反應組分的配比和濃度,而PCR反應條件則包括溫度、時間和核酸擴增的循環數等因素。正確選擇和優化PCR反應體系與反應條件,對于保證PCR反應的高效和可靠具有至關重要的意義。在下文中,我們將詳細探討PCR反應體系和反應條件的重要性,并介紹一些常用的優化策略。

     

    一、標準的PCR反應體系:

           10×擴增緩沖液   10ul

           4dNTP混合物   各200umol/L

           引物        10100pmol 

           模板DNA      0.12ug 

           Taq DNA聚合酶   2.5u 

           Mg2+       1.5mmol/L

           加雙或三蒸水至  100ul

     

      二、PCR反應五要素: 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

      引物: 引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

    設計引物應遵循以下原則:

    ①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。

    ②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。

    ③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現非特異條帶。ATGC盡量隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

    ④避免引物內部出現二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帶。

    ⑤引物3'端的堿基,特別是最末及倒數第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

    ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

    ⑦引物的特異性:引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量: 每條引物的濃度0.11umol10100pmol,以min引物量產生所需要的結果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。

     

      酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應, 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul),濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產物量減少。

     

      dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性,使用時應配成高濃度后,以1M NaOH1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.07.5,小量分裝, -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中,dNTP應為50200umol/L,尤其是注意4dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度降低。

     

      模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關鍵環節之一,傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是: 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,并解離細胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質結合而沉淀; 蛋白酶K能水解消化蛋白質,特別是與DNA結合的組蛋白,再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本,可采用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離,直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。

     

      Mg2+濃度 Mg2+PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響,在一般的PCR反應中,各種dNTP濃度為200umol/L時,Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高,反應特異性降低,出現非特異擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應產物減少。

     

    三、PCR反應條件的選擇

      PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。

      溫度與時間的設置: 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法,雙鏈DNA9095℃變性,再迅速冷卻至40 60℃,引物退火并結合到靶序列上,然后快速升溫至7075℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100300bp)可采用二溫度點法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

      ①變性溫度與時間:變性溫度低,解鏈不夠是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下,93℃~94min足以使模板DNA變性,若低于93℃則需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物變性,就會導致PCR失敗。

      ②退火(復性)溫度與時間:退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃~60℃,可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多,引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度:

         Tm(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T)

         復性溫度=Tm-(510)

      在Tm值允許范圍內, 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合, 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為3060sec,足以使引物與模板之間全結合。

      ③延伸溫度與時間:Taq DNA聚合酶的生物學活性:

             7080150核苷酸/S/酶分子

             7060核苷酸/S/酶分子

             5524核苷酸/S/酶分子

             高于90℃時, DNA合成幾乎不能進行。

    PCR反應的延伸溫度一般選擇在7075℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間,可根據待擴增片段的長度而定,一般1Kb以內的DNA片段,延伸時間1min是足夠 的。34kb的靶序列需34min;擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增,延伸時間要稍長些。

     

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