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    熒光定量PCR的優化方法

     更新時間:2023-08-09 點擊量:280

    使用熒光定量PCR儀進行定量PCR實驗時,通常出現效果不佳的情況,下面小編就帶你了解一些的PCR實驗的優化方法:

    一、基本參數的優化

    1.1 MgCl2的濃度 在PCR反應中,MgCl2的濃度對影響酶的活性是至關重要的,不僅如此,合適的MgCl2的濃度還能在反應中得到較低的Cp(crossing point)值,較高的熒光信號強度以及良好的曲線峰值。所以對其的深度選擇應慎重

    一般來說,對以DNA或cDNA為模板的PCR反應,應選擇2-5 mM濃度的MgCl2,對以mRNA為模板的RT-PCR而言,則應選擇的濃度為4-8 mM。

    1.2 模板的濃度:如果研究者是進行實驗,那么應選擇一系列稀釋濃度的模板來進行實驗,以選擇出最為合適的模板濃度,如果條件困難,也至少要選擇兩個稀釋度(高和中、低濃度)來進行實驗。

    一般而言,使Cp位于15-30個循環比較合適,若大于30則應使用較高的模板濃度,如果Cp小于15則應選擇較低的模板深度。對于Cp值的確定,經驗上是SYBR Green I探針的熒光信號比本底高2倍,雜交探針的熒光強度比本底高0.3倍。

    二、使用SYBR Green I測定DNA時的條件優化

    2.1 MgCl2的濃度:大多數引物-模板對其的要求是2-4 mM。

    2.2 模板的濃度:初次實驗要求做一系列的稀釋濃度,如條件限制,至少完成兩個稀釋的度的測定?;蚪MDNA在50 ng-5 pg之間選擇,質粒DNA在106拷貝數左右選擇。

    2.3 PCR抑制子:通常用于消除抑制子的辦法是將樣本進行稀釋,但是在某些條件下,抑制子的濃度高,而模板量少,稀釋法就不再能達到好的效果,反會使反應的敏感度降低,所以,研究者若要進行實時定量PCR研究,最好選用純化的模板。

    2.4 引物的濃度:引物的濃度是一個影響PCR反應的關鍵因素,其濃度太低,會致使反應不完,若引物太多,則發生錯配以及產生非特異的產物的可能性會大大增加。對于大多數PCR反應,0.5 uM是個合適的濃度,若初次選用這個濃度不理想,可在0.3-1.0 uM之間進行選擇,直至達到滿意的結果。

    2.6 退火溫度:實驗設置的退火溫度應比計算得出的Tm值小5 ℃,然后在1-2 ℃內進行選擇。一般地,退火溫度要根據經驗來確定,這個經驗值往往會同計算得到的Tm值有較大的差距。

    三、用SYBR Green I進行一步法RT-PCR的條件優化

    3.1 MgCl2的濃度:不同的靶分子選用不同的濃度,通常是在4-8 mM之間選擇。

    3.2 模板的濃度:RT-PCR實驗既可以選用總RNA,又可以選用mRNA,其濃度應在1 pg-1 ug之間選擇。對于低模板濃度,可以增加適量的MS2或用alternative RNA 作為載體進行測定。

    3.3 對照設置:每一引物都應設有陰性對照,陽性對照和污染對照。

    四、雜交探針測定DNA

    4.1 MgCl2的濃度:在2-4 mM的基礎上加0.5-1.0 mM,但是不要超過2.0 mM。

    4.2 雜交探針的濃度:初次實驗每個探針用0.2 uM,如果信號強度達不到要求,可以增加至0.4 uM。

    4.3 對照設置:每一引物都要設陰性對照,每一探針都要設陰性對照。每次實驗都要設陽性對照。

    4.4 其它的條件同SYBR Green I。

    五、用雜交探針實時定量RT-PCR

    5.1 MgCl2的濃度:在4-8 mM之間進行選擇。

    5.2 雜交探針的濃度:初實驗用0.2 uM,如果熒光信號強度不足,可以增加至0.4 uM。

    5.3 模板濃度設置:優化的擴增須進行一系列知釋度的實驗,在條件有困難的條件下,至少要進行兩個稀釋度的測定。選用1 pg-1 ug的總RNA或是mRNA,若是模板的濃度過?。ㄐ∮?0 ng/ul),則可加入MS2或alternative RNA作為載體。

    5.4 對照設置:每個引物都要設無模板對照,陽性對照以及污染對照。

    六、關于雜交探針的評價

    在使用雜交探針進行實驗時,必須注意防止探針-引物二聚體的形成和其本身在反應過程中的延伸。引物-探針二聚體的形成,主要是因為探針可與引物的3’末端雜交,其形成以后,會致使此二聚體擴增,從而同目的基因競爭反應的原料,致反應的效率下降。

    探針其本身能同目的基因相結合,且其解鏈溫度高于引物,所以它可能作為引物而引發延伸反應,為了防止發生這種現象,通常是將其3’末端全磷酸化,使之不能延伸,若此磷酸化不全或是沒有磷酸化,就會產生目的基因的副產品,從而干擾實驗結果。鑒于以上這兩點,所以應對探針精心設計,并將其末端全磷酸化。



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