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單細胞RNA測序技術(shù)原理和方法

 更新時(shí)間:2023-11-08 點(diǎn)擊量:655

單細胞RNA測序(scRNA-seq)是一種高分辨率的技術(shù),用于研究細胞內個(gè)體基因的表達模式。它允許對單個(gè)細胞進(jìn)行基因表達譜的分析,揭示了細胞異質(zhì)性、細胞類(lèi)型和基因調控網(wǎng)絡(luò )。

單細胞RNA測序技術(shù)原理:

單細胞RNA測序的基本原理是將每個(gè)單個(gè)細胞的RNA捕獲和測序。它主要包含以下步驟:細胞分離、細胞裂解和RNA捕獲、逆轉錄和擴增、文庫制備和測序、數據分析。

1. 細胞分離:

單個(gè)細胞通常通過(guò)熒光活化細胞分選(FACS)或微流控滴系統等方法進(jìn)行分離和排序。這些技術(shù)可實(shí)現單個(gè)細胞在獨立的孔或微流控腔室中的分離。

2. 細胞裂解和RNA捕獲:

分離的單個(gè)細胞經(jīng)過(guò)細胞裂解,以釋放RNA分子。對于捕獲和條形碼化每個(gè)單個(gè)細胞的RNA分子,可以使用不同的方法,例如基于微流控平臺的inDrops、Drop-seq或使用微孔。 

3. 逆轉錄和擴增:

釋放的RNA分子通過(guò)逆轉錄反應轉化成互補DNAcDNA),逆轉錄過(guò)程中使用包含分子標識符(UMIs)的寡聚dT引物。UMIs有助于在后續步驟中區分和消除潛在的擴增偏差。隨后,經(jīng)過(guò)擴增來(lái)產(chǎn)生足夠用于測序的cDNA。

4. 文庫制備和測序:

擴增的cDNA被片段化,并且接入測序適配體。經(jīng)過(guò)文庫制備后,可以利用高通量測序平臺(如Illumina測序儀)對文庫進(jìn)行測序,以獲得RNA序列信息。

5. 數據分析:

從測序設備中獲取的數據需要經(jīng)過(guò)一系列計算分析。通常包括質(zhì)量控制、比對、表達量定量和歸一化等步驟。使用單細胞生物信息學(xué)工具對這些數據進(jìn)行分析,以識別和分析單個(gè)細胞的基因表達譜。

單細胞RNA測序方法:

單細胞RNA測序的方法主要分為三類(lèi):分液法、微孔法和流式細胞排序結合擴增法。分液法使用微型通道將單個(gè)細胞隔離到獨立的小液滴或腔室中,然后進(jìn)行RNA測序。微孔法通過(guò)將單個(gè)細胞分離到微小孔洞中進(jìn)行RNA捕獲和測序。流式細胞排序結合擴增法則是利用流式細胞分選技術(shù)將單個(gè)細胞分離到96孔板中,并進(jìn)行擴增和測序。



測序設備及應用:

在單細胞RNA測序中,常用的設備主要包括熒光定量PCR儀、細胞分選儀(如FACS)、微流控滴系統、PCR儀、基因測序儀和計算機等。細胞分選儀用于將單個(gè)細胞分離和排序,微流控滴系統用于單細胞RNA分子的捕獲,PCR儀用于逆轉錄和擴增步驟,測序儀用于生成RNA測序數據,(續)在細胞發(fā)育領(lǐng)域,單細胞RNA測序可以幫助研究器官和組織發(fā)育過(guò)程中細胞的分化軌跡和細胞命運決定。它可以鑒定并追蹤不同細胞類(lèi)型的轉錄組動(dòng)態(tài)變化,揭示細胞分化和多能性維持的機制。

在醫學(xué)研究方面,單細胞RNA測序可以幫助醫學(xué)鑒定相關(guān)細胞亞群及發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)聯(lián)。例如,在腫瘤學(xué)中,單細胞RNA測序可以揭示腫瘤細胞的異質(zhì)性和逃逸機制,有助于發(fā)現潛在的靶點(diǎn)。

   在免疫學(xué)中,單細胞RNA測序可以幫助鑒定和描述免疫細胞的次群,并解析不同免疫細胞在免疫應答中的作用和相互作用。這有助于我們更好地理解免疫系統的調控和免疫機制。

   在神經(jīng)科學(xué)中,單細胞RNA測序可以用于研究神經(jīng)系統中不同細胞類(lèi)型的功能特征和轉錄組變化。這有助于我們理解神經(jīng)系統發(fā)育和功能編碼的分子機制,以及神經(jīng)系統研究。

單細胞RNA測序的發(fā)展離不開(kāi)高通量測序技術(shù)的支持。目前,Illumina測序儀是常用的測序儀之一,它具有高度靈敏性和準確性,適合用于單細胞RNA測序。同時(shí),搭配上一系列的前處理和數據分析工具,如Seurat、Scanpy、Cell RangerMonocle等,可以對單細胞RNA測序數據進(jìn)行高效的數據處理、可視化和生物信息學(xué)分析。

     單細胞RNA測序是一種近幾年熱門(mén)的生物技術(shù),可以幫助我們了解細胞的異質(zhì)性、細胞類(lèi)型和基因調控網(wǎng)絡(luò )。它在細胞發(fā)育、疾病研究、免疫學(xué)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應用前景,有助于推動(dòng)我們對生命科學(xué)的深入理解。更多相關(guān)產(chǎn)品請進(jìn)入蘇州阿爾法生物實(shí)驗器材有限公司網(wǎng)站進(jìn)行了解。


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